PL216067B1 - Zastosowanie siarczanu dekstranu - Google Patents

Description

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest nowe zastosowanie siarczanu dekstranu.

Obecnie około 10 milionów ludzi na świecie choruje na cukrzycę typu I, która jest również nazywana cukrzycą zależną od insuliny. Jednakże ocenia się, że liczba chorych dramatycznie rośnie i może wynosić 25 milionów do roku 2010. Obecnie prowadzone są badania nad osiągnięciem trwałego prawidłowego poziomu glukozy u pacjentów z cukrzycą typu I przez wszczepienie komórek β wytwarzających insulinę. Dwie główne procedury to transplantacja unaczynionych przeszczepów trzustki lub izolowanych wysepek Langerhansa. Mimo, że osiągnięto pewne sukcesy z unaczynionymi przeszczepami (cała trzustka), występują wciąż problemy, głównie z powodu ryzyka związanego z operacją chirurgiczną i komplikacji pooperacyjnych. Dodatkowo, istnieje również problem braku odpowiednich dawców trzustki. W przeciwieństwie do tego, transplantacja izolowanych wysepek trzustkowych jest dogodnie przeprowadzana przez wstrzykiwanie wysepek przez wątrobę do żyły wrotnej, gdzie wysepki umiejscawiają się w drzewie wrotnym wątroby.

Nowy protokół transplantacji alogenicznej wysepek, który został ostatnio wprowadzony przez Shapiro i współpracowników ([1] Shapiro A. M. i wsp., „Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med, Vol. 343, Nr 4, str. 230-238 (2000)) będzie bez wątpienia korzystny dla wielu pacjentów z cukrzycą typu I. Jednakże, nawet w przypadku tego nowego rozwiązania okazało się, że transplantacja wysepek z trzustki pojedynczego dawcy nie jest wystarczająca do uzyskania prawidłowego poziomu glukozy u pacjenta ([2] Ryan E. A. i wsp., „Clinical outcomes and insulin secretion after islet transplation with the Edmonton protocol, Diabetes, Vol. 50, Nr 4, str. 710-719 (2001)). Wskutek tego oczekuje się, że konieczność dostarczania ludzkich wysepek stanie się czynnikiem ograniczającym leczenie. Dlatego muszą być znalezione alternatywne źródła komórek wytwarzających insulinę. Jedną z opcji jest użycie wysepek otrzymanych z tkanki zwierzęcej, z których głównym kandydatem są wysepki pochodzące od świń.

Jedną z głównych przeszkód, które muszą zostać pokonane, zanim przeszczep między różnymi gatunkami stanie się możliwy, jest uszkadzająca reakcja zapalna, którą wywołują wysepki świni, gdy są poddawane działaniu świeżej krwi ludzkiej in vitro i in vivo ([3] Bennet W. i wsp. „Damage to porcine islets of Langerhans after exposure to human blood in vitro, or after intraportal transplantation to cynomologus monkeys: protective effects of sCR1 and heparin. Transplantation, Vol. 69, Nr 5, str. 711-719 (2000)). Również ludzkie wysepki wywołują uszkadzającą reakcję zapalną, gdy są poddane działaniu dopasowanej pod względem grup ABO krwi pacjenta w czasie transplantacji wewnątrzwrotnej ([4] Bennet W. i wsp., „Incompatibility between human blood and isolated islets of Langerhants:

a finding with implicoations for clinical intraportal islet transplantation? Diabetes, Vol. 48, Nr 10, str. 1907-1914 (1999)). Reakcja zapalna charakteryzuje się szybkim zużyciem i aktywacją płytek krwi, które przylegają do powierzchni wysepek wzmagając aktywację kaskady krzepnięcia i dopełniacza. Dodatkowo, wysepki zostają otoczone skrzepem i podlegają infiltracji przez leukocyty CD11b⁺, co razem powoduje zniszczenie morfologii komórek i zaburzenie prawidłowego stężenia glukozy u pacjentów (Bennet W. i wsp. [3-4]). Ponadto, stan zapalny może przyspieszyć następującą potem specyficzną komórkową odpowiedź immunologiczną w późnej fazie ([5] Buhler L. i wsp., Adult pocine islet transplantation in baboons treated with conventional immunosuppression or a nonmyeloablative regimen and CD154 blockade. Xenotransplantation, Vol. 9, Nr 1, str. 3-13 (2002); [6] Cantarovich D. i wsp. Rapid failure of pig islet transplantation in non human primates. Xenotransplantation, Vol.9, Nr 1, str. 25-35 (2003); [7] Carrol M. C. i Fisher M. B. Complement and the immune response Curr Opin Immunol, Vol. 9, Nr 1, str. 64-69 (1997); [8] Pratt J. R. i wsp. „Effects of complement inhibition with soluble complement receptor-1 on vascular injury and inflammation during renal allograft rejection in the rat. Am J Pathol, Vol. 149, Nr 6, str. 2055-2066, (1996)). Tak więc zahamowanie Natychmiastowej Reakcji Zapalnej Za Pośrednictwem Krwi (IBMIR), jak nazywana jest uszkadzająca reakcja zapalna, wydaje się mieć krytyczne znaczenie dla sukcesu transplantacji alogenicznej wysepek lub transplantacji wysepek między gatunkami.

Dwa ostatnie badania Buhelera i wsp. [5] i Cantarovicha i wsp. [6] wykazały, że wysepki dorosłej świni są natychmiast niszczone, gdy są przeszczepiane do żyły wrotnej wątroby naczelnych innych niż człowiek nawet w warunkach intensywnej konwencjonalnej immunosupresji zgodnie z wcześniejszą literaturą. Autorzy wyciągnęli z tych badań wniosek, że silna wrodzona odpowiedź immunoloPL 216 067 B1 giczna, IBMIR, na którą nie wpływają leki immunosupresyjne, jest zaangażowana w niszczenie wysepek od innego gatunku.

Fiorante i wsp. badali zastosowanie siarczanu dekstranu w zapobieganiu nadostrego odrzucania (HAR) unaczynionych niezgodnych przeszczepów między gatunkami ([9] Fiornate P. i wsp., Low molecular weight dextran sulfate prevents complement activation and delays hyperacute rejection in pig-to-human xenotransplantation models. Xenotransplantation, Vol. 8, Nr 1, str. 24-35, (2001)). Płuca świńskie poddane perfuzji za pomocą ludzkiej krwi z antykoagulacyjnym cytrynianem wykazywały HAR po 30 minutach w modelu przeszczepu między różnymi gatunkami. Jednakże dodanie siarczanu dekstranu w ilości 2 mg/ml przedłużało przetrwanie płuc do 200 minut. W HAR unaczynionych całych narządów pośredniczy działanie przeciwciał w ludzkiej krwi, które identyfikują i wiążą odsłonięte antygeny na komórkach śródbłonka naczyń krwionośnych przeszczepianych narządów. Reakcja HAR za pośrednictwem przeciwciał jest wzmacniana przez komponenty układu dopełniacza ([8] Pratt J. R. i wsp.; [10] Baldwin W. M. i wsp., „Complment in organ transplantation. Contributions to inflammation, injury, and rejection. Transplantation, Vol. 59, Nr 6, str. 797-808 (1995); [11] Brauer R.B. i wsp., „The contribution of terminal complement components to acute and hyperacute allograft rejection in the rat, Transsplantation, Vol. 59, Nr 2, str. 288-293, (1995)). Ponieważ wiadomo, że siarczan dekstranu również hamuje aktywację dopełniacza ([9] Fiornate P. i wsp.; [12] Wuillemin W. A. i wsp. „Potentiation of C1 inhibitor by glycosaminoglycans: dextran sulfate species are effective inhibitors of in vitro complement activation In plasma, J Immunol, Vol. 159, Nr 4, str. 1953-1960 (1997)) uważa się, że przedłużone przetrwanie płuc w przypadku zastosowania siarczanu dekstranu w badanym modelu przeszczepu między różnymi gatunkami wynika z działania siarczanu dekstranu przeciwko dopełniaczowi.

Nakano i wsp. przeszczepiali izolowane jednorodne wysepki do wątroby myszy indukowanych STZ w celu zbadania roli czynnika wzrostu hepatocytów (HGF) w polepszaniu hiperglikemii ([13] Nakano M. i wsp. „Hepatocyte growth factor is essential for amelioration of hyperglycemia in streptozotocin-induced diabetic mice receiving a marginal mass of intrahepatic islefts grafts, Transplantation, Vol. 69, Nr 2, str. 214-221 (2000)). Wiadomo, że siarczan dekstranu nasila działanie HGF i dlatego HGF był podawany dootrzewnowo myszom w połączeniu z siarczanem dekstranu. To powodowało wystąpienie prawidłowego stężenia glukozy u wszystkich badanych myszy. Również podawanie samego siarczanu dekstranu wywoływało pewien korzystny efekt u kilku myszy, lecz nie w przypadku, gdy miejscem przeszczepienia wysepek była przestrzeń podtorebkowa nerki.

Dodatkowe leczenie przeciwciałem anty-HGF myszy, którym podano siarczan dekstranu całkowicie znosiło korzystne działanie siarczanu dekstranu, co wskazuje na to, że w działaniu siarczanu dekstranu w tym modelu alogenicznego przeszczepu wysepek u myszy pośredniczy endogenny HGF.

Thomas i wsp. ([14] Thomas H. i wsp. „Sulfonated dextran inhibits complement activation and complement- dependent cytotoxixity in an in vitro model of hyperacute xenograft rejection, Mol Immunol, Vol. 33, Nr 7-8, str. 643-648 (1996)) wykazali, że rozpuszczalne pochodne dekstranu hamują aktywację dopełniacza i uszkodzenie, w którym pośredniczy dopełniacz in vitro. Świńskie komórki śródbłonka aorty inkubowane w ludzkim osoczu powodowały zużycie dopełniacza i odkładanie aktywowanych fragmentów C3, C5 i kompleksu atakującego błonę na komórkach śródbłonka. Dodanie 25 mg/ml siarczanu dekstranu CMDB25 hamowało aktywację dopełniacza i odkładanie kompleksu cytolitycznego na komórkach. Rodzimy dekstran nie powodował takiego działania.

Niniejszy wynalazek jest pozbawiony tych i innych wad poprzedniego stanu techniki. Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie siarczanu dekstranu lub jego farmaceutycznie akceptowalnej soli lub solwatu do wytwarzania leku do leczenia Natychmiastowej Reakcji Zapalnej Za Pośrednictwem Krwi (IBMIR).

Korzystnie, wspomniana IBMIR jest spowodowana przez wystawienie przeszczepu komórkowego na działanie krwi po przeszczepie wspomnianego przeszczepu komórkowego do organizmu obcego biorcy.

Korzystnie, wspomniany przeszczep komórkowy jest przeszczepiany do organizmu człowieka.

Korzystnie, wspomniany przeszczep komórkowy jest wybrany z listy zawierającej;

- allogeniczny przeszczep komórkowy i

- ksenogenny przeszczep komórkowy.

W innym korzystnym wariancie, wspomniany przeszczep komórkowy jest wybrany z listy zawierającej:

- indywidualną komórkę;

- gniazdo komórek i

PL 216 067 B1

- nie-unaczynioną tkankę.

W jeszcze innym wariancie, wspomniany przeszczep komórkowy stanowi wysepki Langerhansa.

Korzystnie, wspomniany siarczan dekstranu ma masę cząsteczkową poniżej 20000, korzystnie poniżej 10000.

W innym korzystnym wariancie, wspomniany siarczan dekstranu zawiera 10 - 25%, korzystnie 15 - 20% siarki

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie siarczanu dekstranu lub jego farmaceutycznie akceptowalnej soli lub solwatu do wytwarzania leku do leczenia stanu wybranego z grupy obejmującej morfologiczne rozerwanie przeszczepionego przeszczepu komórkowego oraz odrzucenie przeszczepu komórkowego.

Korzystnie, wspomniane morfologiczne rozerwanie przeszczepu komórkowego lub odrzucenie przeszczepu komórkowego jest spowodowane Natychmiastową Reakcją Zapalną Za Pośrednictwem Krwi (IBMIR).

Korzystnie, wspomniany przeszczep komórkowy jest przeszczepiany do organizmu człowieka.

Korzystnie, wspomniany przeszczep komórkowy jest wybrany z listy zawierającej;

- allogeniczny przeszczep komórkowy lub

- ksenogenny przeszczep komórkowy.

W innym korzystnym wariancie, wspomniany przeszczep komórkowy jest wybrany z listy zawierającej;

- indywidualną komórkę;

- gniazdo komórek lub

- nie-unaczynioną tkankę.

W jeszcze innym korzystnym wariancie, wspomniany przeszczep komórkowy stanowi wysepki Langerhansa.

Korzystnie, wspomniany siarczan dekstranu ma masę cząsteczkową poniżej 20000, korzystnie poniżej 10000.

Korzystnie, wspomniany siarczan dekstranu zawiera 10 - 25%, korzystnie 15 - 20% siarki. Wynalazek znajduje zastosowanie w sposobie leczenia Natychmiastowej Reakcji Zapalnej Za Pośrednictwem Krwi (IBMIR).

Wynalazek znajduje również zastosowanie w sposobie leczenia morfologicznego rozerwania przeszczepów komórkowych powodowanego przez IBMIR.

Wynalazek znajduje także zastosowanie w sposobie leczenia odrzucania przeszczepów komórkowych powodowanego przez IBMIR.

W skrócie, wynalazek dotyczy zastosowania siarczanu dekstranu i jego pochodnych do leczenia Natychmiastowej Reakcji Zapalnej Za Pośrednictwem Krwi (IBMIR). Ta nowo scharakteryzowana postać stanu zapalnego jest wyzwalana, gdy komórki lub gniazda komórek są poddane działaniu krwi in vitro in vivo. Bardzo ważnym przykładem IBMIR jest sytuacja, gdy alogeniczne lub ksenogenne przeszczepy komórkowe są przeszczepiane do organizmu dawcy będącego ssakiem, szczególnie człowiekiem. IBMIR prowadzi wówczas do morfologicznego rozerwania i zniszczenia przeszczepionych komórek lub gniazd komórek, co objawia się utratą struktury i formy. Ponadto, IBMIR również ogólnie powoduje odrzucenie przeszczepu komórkowego.

Podawanie siarczanu dekstranu lub jego pochodnych znosi szkodliwe działanie IBMIR i skutecznie zapobiega odrzuceniu przeszczepu i morfologicznemu rozerwaniu przeszczepów komórkowych. Siarczan dekstranu według wynalazku może być siarczanem dekstranu o masie cząsteczkowej od małej (LMW-DS), np. od kilkuset lub kilku tysięcy Daltonów (Da) do dużej (HMW-DS), ogólnie o masie cząsteczkowej ponad 500000 (500000 Da), np. > 1000000 (1000000 Da), Korzystne działanie siarczanu dekstranu jest szczególnie wyrażone w przypadku LMW-DS, lecz pozytywny efekt jest również widoczny przy podawaniu siarczanu dekstranu o większej masie cząsteczkowej. Korzystne działanie większych cząsteczek dekstranu w przypadku IBMIR według wynalazku może być nasilane przez zwiększanie zawartości siarki, tj. liczby grup siarczanowych na resztę glukozylową w łańcuchu dekstranu. LMW-DS ogólnie posiada średnią masę cząsteczkową poniżej 20000 (20000 Da), jak poniżej 10000 (10 000 Da) i np. około 5000 (5000 Da). Średnia zawartość siarki w LMW-DS może wynosić około 10 do 25%, jak 15 do 20%, co odpowiada około dwóm grupom siarczanowym na resztę glukozylową. Dla siarczanu dekstranu o średniej masie cząsteczkowej większej niż 20000 (20000 Da) można zastosować większą zawartość siarki.

PL 216 067 B1

Siarczan dekstranu i jego pochodne mogą być podawane układowo do miejsca IBMIR lub transplantacji komórek lub mogą być podawane bezpośrednio (miejscowo) do tego miejsca. Tak więc, zgodnie z wynalazkiem, siarczan dekstranu i jego pochodne mogą być podawane doustnie, dożylnie, dootrzewnowo, podskórnie, podpoliczkowo, doodbytniczo, śródskórnie, donosowo, dotchawiczo, dooskrzelowo, miejscowo lub jakąkolwiek inną drogą pozajelitową lub poprzez inhalację w postaci preparatu farmaceutycznego zawierającego składnik czynny w farmaceutycznie akceptowalnej postaci dawkowania.

W leczeniu ssaków, szczególnie ludzi, siarczan dekstranu i jego pochodne mogą być podawane oddzielnie, lecz ogólnie będą podawane w preparacie farmaceutycznym w połączeniu z farmaceutycznie akceptowalnym adiuwantem, rozcieńczalnikiem lub nośnikiem, który może być wybrany zgodnie z zamierzoną drogą podawania i standardową praktyką farmaceutyczną.

Ilość siarczanu dekstranu lub jego pochodnych w preparacie będzie zależała od ciężkości schorzenia i leczonego pacjenta, jak również faktycznego preparatu i zastosowanej drogi podania i może być określona rutynowo przez znawcę. Stężenie poddawanego siarczanu dekstranu lub jego pochodnych według niniejszego wynalazku nie powinno być zbyt duże w celu zminimalizowania jakichkolwiek działań ubocznych związanych z siarczanem dekstranu. W większości sytuacji klinicznych odpowiednie dawki siarczanu dekstranu lub jego pochodnych w leczeniu i/lub zapobieganiu u ssaka, szczególnie człowieka, są dawkami, które powodują średnie stężenie we krwi poniżej 5 mg/ml, prawdopodobnie mniej niż 2 mg/ml i szczególnie mniej niż 1 mg/ml. Korzystny zakres stężeń wynosi pomiędzy 0,01 mg/ml a 1 mg/ml siarczanu dekstranu, jak powyżej 0,05 mg/ml, powyżej 0,08 mg/ml lub powyżej 0,1 mg/ml i/lub mniej niż 0,8 mg/ml, mniej niż 0,4 mg/ml lub mniej niż 0,2 mg/ml, np. w zakresie stężeń 0,01 mg/ml i 0,2 mg/ml i/lub 0,05 mg/ml i 0,2 mg/ml.

Siarczan dekstranu według wynalazku jest szczególnie odpowiedni do zapobiegania odrzucania przeszczepów wydzielających insulinę komórek β u pacjentów chorych na cukrzycę typu I. U tych pacjentów, wysepki Langerhansa od innych ludzi lub ssaków, korzystnie wysepki świńskie, mogą być przeszczepiane przez wstrzykiwanie wysepek do żyły wrotnej pacjentów. Jednakże po zadziałaniu krwi pacjenta na wysepki, wyzwalana jest IBMIR i niszczona jest czynność wysepek regulująca poziom insuliny, a wysepki są odrzucane. Dlatego terapeutyczne stężenie siarczanu dekstranu lub jego pochodnych jest korzystnie uzyskiwane, przynajmniej miejscowo, w miejscu przeszczepu po wykonaniu przeszczepu komórek lub gniazd komórek. Może to być uzyskane przez podanie siarczanu dekstranu przed faktyczną transplantacją. Alternatywnie, wysepki mogą być wstrzyknięte w roztworze zawierającym siarczan dekstranu zgodnie z niniejszym wynalazkiem w celu zahamowania IBMIR i zapobieżenia jakiemukolwiek niszczeniu lub odrzucaniu wysepek, co umożliwia uzyskanie prawidłowego stężenia glukozy u pacjentów. Stężenie siarczanu w takiej komórce i roztworze siarczanu dekstranu jest korzystnie wystarczająco duże, tak że może być uzyskane terapeutyczne stężenie siarczanu dekstranu, tj. korzystnie poniżej 5 mg/ml, korzystniej 0,01 mg/ml do 1,0 mg/ml i szczególnie

0,01 mg/ml do 0,2 mg/ml, co najmniej miejscowo w miejscu transplantacji przez pierwsze godziny po transplantacji. Siarczan dekstranu będzie następnie rozprzestrzeniał się z miejsca transplantacji, co będzie obniżało miejscowe stężenie siarczanu dekstranu. W pewnych zastosowaniach nie potrzeba dodatkowego siarczanu dekstranu do zahamowania IBMIR, morfologicznego rozrywania i/lub odrzucania przeszczepu komórkowego, ponieważ terapeutyczne stężenie siarczanu dekstranu jest prawdopodobnie konieczne wyłącznie przez pierwsze 24-48 godzin po przeszczepie. Jednakże, gdy to jest wymagane, może być podany dodatkowy siarczan dekstranu, np. dożylnie, dootrzewnowo lub inną drogą podania. Jak rozumie znawca, podawanie roztworu siarczanu dekstranu zawierającego komórki lub gniazda komórek, które mają być podane może również być kojarzone z podaniem siarczanu dekstranu lub jego pochodnych przed faktyczną transplantacją.

Siarczan dekstranu i jego pochodne mogą również być kojarzone z innymi środkami terapeutycznymi, które są użyteczne w leczeniu odrzucania przeszczepu tkanki. Odpowiednimi, lecz nie ograniczającymi przykładami takich środków immunosupresyjnych, które mogą być używane razem z siarczanem dekstranu do leczenia odrzucania przeszczepu są cyklosporyna, takrolimus, kortykosteroidy, rapamycyna (sirolimus) i mykofenolan mofetilu. Podawanie siarczanu dekstranu według niniejszego wynalazku może również być skoordynowane z podawaniem przeciwciał anty-TF i/lub inaktywowanego miejscowo czynnika VIla, które również wykazują pewne działanie hamujące IBMIR.

Krótki opis rysunków

Wynalazek razem z jego dalszymi celami i zaletami może być najlepiej zrozumiany w odniesieniu do następującego opisu z towarzyszącymi mu rysunkami, w których;

PL 216 067 B1

Fig. 1 jest diagramem ilustrującym wpływ LMW-DS na tworzenie C3a w czasie perfuzji wysepek świńskich za pomocą krwi ludzkiej;

Fig. 2 jest diagramem ilustrującym wpływ LMW-DS. na tworzenie sC5b-9 w czasie perfuzji świńskich wysepek za pomocą krwi ludzkiej;

Fig. 3 jest diagramem ilustrującym bezpośredni wpływ LMW-DS na układ dopełniacza, gdy ludzkie osocze jest inkubowane w obecności LMW-DS;

Fig. 4 ilustruje dystrybucję leukocytów w wysepkach świńskich po perfuzji krwią ludzką nie zawierającą LMW-DS;

Fig. 5 ilustruje dystrybucję leukocytów w wysepkach świńskich po perfuzji krwią ludzką zawierającą 1 mg/ml LMW-DS;

Fig. 6 ilustruje dystrybucję płytek krwi w wysepkach świńskich po perfuzji krwią ludzką nie zawierającą LMW-DS;

Fig. 7 ilustruje dystrybucję płytek krwi w wysepkach świńskich po perfuzji krwią ludzką zawierającą 1 mg/ml LM-DS;

Fig. 8 ilustruje ekspresję insuliny w wysepkach świńskich po wewnątrz-wrotnej transplantacji myszom pozbawionym grasicy bez leczenia LMW-DS;

Fig. 9 ilustruje ekspresję insuliny w wysepkach świńskich po wewnątrz-wrotnej transplantacji myszom pozbawionym grasicy chorych na cukrzycę po leczeniu LMW-DS;

Fig. 10 ilustruje dystrybucję leukocytów w wysepkach świńskich po wewnątrz-wrotnej transplantacji myszom pozbawionym grasicy chorych na cukrzycę bez leczenia LMW-DS i

Fig. 11 ilustruje dystrybucję leukocytów w wysepkach świńskich po wewnątrzwrotnej transplantacji myszom pozbawionym grasicy chorym na cukrzycę po leczeniu LMW-DS.

Szczegółowy opis

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest ogólnie nowe nieoczekiwane działanie siarczanu dekstranu na Natychmiastową Reakcję Zapalną Za Pośrednictwem Krwi (IBMIR) i morfologiczne rozerwanie i odrzucanie przeszczepów komórkowych wywoływane przez IBMIR.

IBMIR jest stosunkowo niedawno zidentyfikowaną reakcją wyzwalaną przez działanie lub kontakt komórek lub gniazd komórek z obcą krwią. IBMIR charakteryzuje się ekspresją czynnika tkankowego na komórkach, która wyzwala miejscowe powstawanie trombiny. Później aktywowane płytki krwi przylegają do powierzchni komórek wzmagając aktywację krzepnięcia i układów dopełniacza. Dodatkowo, włączane są leukocyty i infiltrują komórki. Te działania wspólnie powodują rozerwanie i zniszczenie integralności morfologicznej komórek w ciągu pierwszych kilku godzin po kontakcie w obcą krwią. IBMIR również przyspiesza późniejszą specyficzną komórkową odpowiedź immunologiczną w późnej fazie.

Bardzo ważnym przykładem IBMIR jest sytuacja, gdy komórki lub gniazda komórek są przeszczepiane do organizmu, korzystnie, ssaka i szczególnie człowieka. W czasie kontaktu z krwią pacjenta komórki wyzwalają IBMIR, która powoduje rozerwanie morfologiczne komórek i, ogólnie, odrzucenie przeszczepu komórek. IBMIR była wykrywana zarówno w alogenicznych przeszczepach komórek, gdzie komórki od dawcy posiadającego krew dopasowaną pod względem grupy ABO są przeszczepiane pacjentowi, jak i w ksenogennych przeszczepach komórek, włącznie z ksenogennymi przeszczepami komórek i/lub gniazd komórkowych od świni do małpy i od świni do człowieka.

Wyrażenie „przeszczep komórkowy ogólnie oznacza w niniejszym wynalazku pojedynczą komórkę, kilka pojedynczych komórek lub gniazdo wielu komórek przeszczepianych dawcy będącego ssakiem, a szczególnie człowiekiem. Również większe gniazda nie-unaczynionych tkanek są zawarte w określeniu przeszczep komórkowy, jak stosuje się tutaj. Przykładem przeszczepów komórkowych według niniejszego wynalazku są alogeniczne lub ksenogenne wysepki Langerhansa przeszczepiane do żyły wrotnej wątroby pacjentów chorych na cukrzycę typu I. Dalszym przykładem może być przeszczepienie embrionalnej ksenogennej tkanki/komórek nerwowych do prążkowia pacjentów chorych na chorobę Parkinsona.

Jak w skrócie omówiono w punkcie dotyczącym tła wynalazku, obiecującą procedurą uzyskiwania prawidłowego stężenia glukozy we krwi u pacjentów z cukrzycą typu I jest przeszczepienie komórek β wytwarzających insulinę np. do żyły wrotnej. Odpowiednie komórki wytwarzające insulinę np. w postaci wysepek Langerhansa, mogą być uzyskane zarówno od dawców alogenicznych, jak i ksenogennych. Ponieważ wysepki od kilku dawców są konieczne do uzyskania prawidłowego stężenia glukozy we krwi i z powodu braku odpowiednich ludzkich dawców mogą być użyte ksenogenne, korzystnie świńskie, wysepki. Jednakże zarówno alogeniczne, jak i ksenogenne wysepki wywołują IBPL 216 067 B1

MIR, gdy są poddane działaniu krwi biorcy. W rezultacie w ciągu kilku godzin po przeszczepie komórki zostają rozerwane i zniszczone, co ogólnie przejawia się utratą integralności, struktury i postaci komórek. To powoduje początkowo znaczne zwiększenie wydzielania glukozy z wysepek Langerhansa, a następnie zmniejszenie lub brak wydzielania insuliny. Innymi słowy, wkrótce po przeszczepie pojawia się utrata prawidłowego stężenia glukozy we krwi. Ponadto, IBMIR również powoduje odrzucenie przeszczepu komórkowego.

Podawanie konwencjonalnych leków immunosupresyjnych, które zapobiegają wytwarzaniu przeciwciał i odrzuceniu przeszczepu, nie ma wpływu na IBMIR lub odrzucenie przeszczepu komórkowego powodowanego przez IBMIR. To wskazuje, że główny mechanizm IBMIR i odrzucania przeszczepów komórkowych różni się od mechanizmu odrzucania obserwowanego przy przeszczepianiu całych narządów i unaczynionej tkanki.

Poniżej opisano bardziej szczegółowo objawy IBMIR, a w szczególności zużywanie płytek krwi, krzepnięcie i aktywację dopełniacza oraz infiltrację leukocytów. Ponadto, opisano wpływ siarczanu dekstranu na odpowiednie objawy. Bardziej szczegółowy opis tych działań siarczanu dekstranu można znaleźć w przykładach.

Począwszy od zużywania płytek krwi, IBMIR wpływa na liczbę płytek krwi we w krwi mającej kontakt z alogenicznymi lub ksenogennymi komórkami lub gniazdami komórek. Znaczące zmniejszenie liczby wolnych krążących płytek krwi może być stwierdzony we krwi w następstwie kontaktu krwi z komórkami. Płytki krwi zostają aktywowane i przylegają do komórek, co powoduje agregację płytek krwi. W następstwie przylegania do komórek, płytki krwi uwalniają kilka substancji włącznie z fosfolipidami płytek krwi, które są ważne dla tworzenia skrzepu i aktywacji układu krzepnięcia.

Podawanie skutecznej ilości siarczanu dekstranu według wynalazku hamuje zużywanie płytek krwi, co przejawia się wzrostem ilości płytek krwi we krwi, która powraca do wartości obserwowanej we krwi przed kontaktem z obcymi komórkami lub gniazdami komórek. Dodatkowo, przyleganie płytek krwi do komórek jest znacznie zmniejszane przez siarczan dekstranu mimo, że nadal można obserwować śladowe ilości płytek krwi otaczających wysepki. Działanie tych pozostających płytek krwi niekoniecznie jest jednak wadą. Badania na zwierzętach wykazały, że po przeszczepie upływa co najmniej tydzień, zanim można zaobserwować rozwój naczyń ([15] Korsgren O. i wsp. Angiogenesis and angioarchitecture of transplanted fetal porcine islet-like cell clusters, Transpaltation, Vol. 68, Nr 11, str. 1761-1766 (1999); [16] Menger M. D. i wsp. „Revascularization and microcirculation of freely grafted oslets of Langerjans, World J Surg, Vol. 25, Nr 4, str. 509-515 (2001)). Płytki krwi zawierają wiele ważnych czynników wzrostu, takich jak pochodzący z płytek krwi czynnik wzrostu (PDGF), naczyniowy śródbłonkowy czynnik wzrostu (VEGF) i czynnik wzrostu fibroblastów (FGF) ([17] Jensen R. L. „Growth factor- mediadet angiogenesis in the malignant progression of glial tumors; a review, Surg Neurol, Vol. 49, Nr 2, str. 189-195, discussion 196 (1998); [18] Dunn I. F. i wsp. Growth factors in glioma angiogenesis: FGFs, PDGF, EGF, and TGFs, J Neurooncol, Vol. 50, Nr 1-2, str. 121-137 (2000)), które mogą wspomagać rewaskularyzację i wszczepianie wysepek do organizmu pacjenta. W przypadku klinicznego przeszczepu wysepek, gdy wysepki są wszczepiane do żyły wrotnej, wieniec przylegających płytek krwi może w podobny sposób wspomagać wszczepienie i przetrwanie w tkance wątrobowej.

Poprzez kontakt z krwią obce komórki aktywują układ krzepnięcia wskutek ekspresji czynników tkankowych na komórkach i poprzez substancje uwolnione przez przylegające i agregujące płytki krwi. W skrócie, czynnik tkankowy (TF) wytwarzany przez te komórki tworzy kompleksy z czynnikiem krzepnięcia krwi VIIa i działa enzymatycznie na czynnik X tworząc aktywowany czynnik X (FXa). Potem następuje kaskada aktywacji różnych czynników, które ewentualnie powodują wytwarzanie trombiny z protrombiny. Trombina z kolei powoduje polimeryzację cząsteczek fibrynogenu we włókna fibryny tworząc skrzep fibryny wokół komórek, co jest dobrze znane osobie biegłej w sztuce. Trombina również aktywuje wewnętrzną ścieżkę zapoczątkowującą krzepnięcie krwi, w której czynnik XII (czynnik Hagemana) jest aktywowany i z kolei enzymatycznie aktywuje czynnik XI (prekursor tromboplastyny), co powoduje powstanie FXIa, aktywowanej postaci czynnika XI. Również ta ścieżka ewentualnie powoduje powstanie trombiny z protrombiny, jak w wewnętrznej ścieżce aktywowanej TF.

Krzepnięcie krwi może być zahamowane przez antytrombinę, krążący inhibitor proteazy seryny, który inaktywuje FXIIa, FXIa i trombinę, tworząc kompleksy czynnik XIIa-antytrombina (FXIIa-AT), czynnik XIa-antytrombina (FXIa-AT) i trombina-antytrombina (TAT). Dodatkowo, inhibitor esterazy C1 jest znanym inhibitorem FXIa i FXIIa tworząc kompleksy czynnik XIa-inhibitor esterazy C1 (FXIa-C1 INH) i czynnik XIIa-inhibitor esterazy C1.

PL 216 067 B1

Skrzep fibryny utworzony wokół komórek lub gniazd komórek może być usunięty przez działanie plazminy układu fibrynolitycznego. Plazmina rozkłada skrzep fibryny na produkty rozkładu fibryny, przez co zapobiega dalszemu tworzeniu skrzepu. Jednakże działanie plazminy jest hamowane przez antyplazminę alfa 2, która wiąże i inaktywuje wolną plazminę tworząc kompleks plazminaantyplazmina alfa 2 (PAP).

IBMIR charakteryzuje się tworzeniem skrzepów fibryny wokół komórek poddanych działaniu obcej krwi in vitro i in vivo. Dodatkowo obserwuje się wzrost FXIa-AT, FXIIa-AT, TAT i 6 PAP. IBMIR nie wywiera wpływu na ilość FXIa-C1 INH lub FXIIa-C1 INH. Podawanie skutecznej ilości siarczanu dekstranu według wynalazku znosi wpływ IBMIR na aktywację krzepnięcia, co przejawia się zmniejszeniem ilości FXIa-AT, FXIIa-AT, TAT i PAP wykrywanych we krwi. W działaniu siarczanu dekstranu na aktywację krzepnięcia może pośredniczyć sam układ krzepnięcia, hamujące działanie siarczanu dekstranu na aktywację płytek lub oba te czynniki.

Po aktywacji płytek krwi i krzepnięcia, w IBMIR występuje kaskada dopełniacza. Jednym z komponentów układu dopełniacza jest C3 który, gdy jest aktywowany, jest rozszczepiany na mniejszy fragment C3, peptydowy mediator zapalenia i większy fragment C3b. C3b z kolei wiąże się z innymi komponentami układu dopełniacza tworząc konwertazę C5, która rozszczepia C5 na C5a, który dyfunduje i na C5b, który łączy się z powierzchnią komórki. Związany C5b następnie wiąże się z czterema innymi komponentami dopełniacza tworząc błonowy kompleks atakujący c5b-9. Ten kompleks przesuwa fosfolipidy błonowe tworząc duże kanały trans-błonowe, które przerywają błonę i umożliwiają dowolną dyfuzję jonów i małych cząsteczek. Tak więc komórka nie może zachować swojej stabilności osmotycznej i ulega lizie wskutek napływu wody i utraty elektrolitów.

Większość zużycia płytek krwi zachodzi zanim działanie IBMIR za pośrednictwem dopełniacza może być wykryte, co sugeruje, że reakcja krzepnięcia może indukować aktywację dopełniacza. IBMIR powoduje znacząca aktywację dopełniacza, co można stwierdzić przez wzrost C3a i rozpuszczalnego błonowego kompleksu atakującego sC5b-9 we krwi. Podawanie skutecznej ilości siarczanu dekstranu według wynalazku zmniejsza ilość tych komponentów dopełniacza we krwi w sposób zależny od dawki.

IBMIR również charakteryzuje się infiltracją komórek lub gniazd komórek przez leukocyty. Infiltracja komórek przez cechujące się różnokształtnością jąder komórkowych komórki CD11b⁺ i monocyty jest wyraźnie wykrywana przez barwienie immunohistochemiczne. Analizy immunohistochemiczne wykazały, że infiltracja leukocytów była całkowicie zniesiona przez podawanie siarczanu dekstranu.

Pierwszym aspektem wynalazku jest siarczan dekstranu lub jego farmaceutycznie akceptowalna pochodna do wytwarzania leku do leczenia Natychmiastowej Reakcji Zapalnej Za Pośrednictwem Krwi (IBMIR).

Innym aspektem wynalazku jest siarczan dekstranu lub jego farmaceutycznie akceptowalna pochodna do wytwarzania leku do leczenia morfologicznego rozrywania przeszczepów komórkowych. Również zastosowanie siarczanu dekstranu lub jego farmaceutycznie akceptowalnej pochodnej do wytwarzania leku do leczenia odrzucania przeszczepów komórkowych jest w zakresie niniejszego wynalazku. Te dwa działania, tj. rozrywanie morfologiczne komórek i odrzucanie przeszczepów komórek, gniazd komórek, lub nie-unaczynionej tkanki w ssaka, korzystnie człowieka, są skutkiem szkodliwego działania IBMIR. Działanie IBMIR na przeszczepy komórkowe występuje zarówno w przeszczepianiu od człowieka do człowieka przy zgodności grup krwi ABO, jak i przy użyciu innych dawców, korzystnie świń. Tak więc siarczan dekstranu wywiera korzystne działanie terapeutyczne zarówno przy przeszczepianiu alogenicznym, jak i ksenogennym.

Aby uniknąć wątpliwości, termin „leczenie, jak stosuje się tutaj, obejmuje działanie terapeutyczne i profilaktyczne w odniesieniu do IBMIR. „Farmaceutycznie akceptowalna pochodna obejmuje sole i solwaty.

Siarczan dekstranu lub jego pochodne zastosowane według wynalazku mogą mieć masę cząsteczkową od małej (LMW-DS), np. od kilkuset do kilku tysięcy Daltonów (Da) do dużej (HMW-DS), ogólnie masę cząsteczkową powyżej 500000 (500000 Da), np. > 1000000 (1000000 Da). Korzystne działanie siarczanu dekstranu jest szczególnie wyrażone w przypadku LMW-DS, lecz pozytywny efekt jest również obserwowany przy podawaniu siarczanu dekstranu o większej masie cząsteczkowej. Jednakże większe cząsteczki siarczanu dekstranu mogą aktywować FXII wywołując pewne działania uboczne, co jest omawiane bardziej szczegółowo poniżej. Korzystne działanie większych cząsteczek siarczanu dekstranu w odniesieniu do IBMIR według wynalazku może być wzmocnione przez zwiększenie zawartości siarki, tj. liczby grup siarczanowych na resztę glukozylową w łańcuchu dekstranu.

PL 216 067 B1

LMW-DS ogólnie ma masę cząsteczkową poniżej 20000 (20000 Da), jak poniżej 10000 (10000 Da) i np. około 5000 (5000 Da). Średnia zawartość siarki w LMW-DS może wynosić około 10 do 25%, jak 15 do 20%, co odpowiada około 2 grupom siarczanowym na resztę glukozylową. W przypadku siarczanu dekstranu o średniej masie cząsteczkowej powyżej 20000 (20000 Da), może być zastosowana wyższa zawartość siarki.

Wynalazek może znaleźć zastosowanie w sposobie leczenia IBMIR, który obejmuje podawanie terapeutycznie skutecznej ilości siarczanu dekstranu lub jego farmaceutycznie akceptowalnej pochodnej pacjentowi potrzebującemu takiego leczenia.

Wynalazek może znaleźć również zastosowanie w sposobie leczenia odrzucania przeszczepu komórkowego, który obejmuje podawanie terapeutycznie skutecznej ilości siarczanu dekstranu lub jego farmaceutycznie akceptowalnej pochodnej pacjentowi potrzebującemu takiego leczenia i w sposobie leczenia morfologicznego rozrywania przeszczepów komórkowych, który obejmuje podawanie terapeutycznie skutecznej ilości siarczanu dekstranu lub jego farmaceutycznie akceptowalnej pochodnej pacjentowi potrzebującemu takiego leczenia.

Siarczan dekstranu i jego pochodne mogą być podawane ogólnoustrojowo w celu dostarczenia do miejsca IBMIR lub przeszczepienia komórek lub mogą być podawane bezpośrednio (miejscowo) do tego miejsca przy użyciu odpowiednich sposobów podawania znanych osobie biegłej w sztuce.

Tak więc, zgodnie z wynalazkiem, siarczan dekstranu i jego pochodne mogą być podawane doustnie, dożylnie, dootrzewnowo, podskórnie, podpoliczkowo, doodbytniczo, śródskórnie, donosowo, dotchawiczo, dooskrzelowo, miejscowo, jakąkolwiek inną drogą pozajelitową lub przez inhalację w postaci preparatu farmaceutycznego zawierającego składnik czynny w farmaceutycznie akceptowalnej postaci dawkowania. W zależności od formy przeszczepienia komórek, miejsca przeszczepienia i leczonego pacjenta, jak również drogi podania, kompozycje mogą być podawane w różnych dawkach.

W leczeniu ssaków, a szczególnie ludzi, siarczan dekstranu i jego pochodne mogą być podawane oddzielnie, lecz będą ogólnie podawane jako preparat farmaceutyczny w połączeniu z farmaceutycznie akceptowalnym adiuwantem, rozcieńczalnikiem lub nośnikiem, które mogą być wybrane zgodnie z zamierzoną drogą podania i standardową praktyką farmaceutyczną.

Ilości siarczanu dekstranu lub jego pochodnych w preparacie będą zależały od nasilenia schorzenia i od leczonego pacjenta, jak również faktycznego preparatu i zastosowanej drogi podania i mogą być określone rutynowo przez osobę biegłą w sztuce. Stężenie podawanego siarczanu dekstranu lub jego pochodnych według niniejszego wynalazku nie powinny być zbyt wysokie w celu zminimalizowania jakichkolwiek działań ubocznych związanych z siarczanem dekstranu. W większości sytuacji klinicznych odpowiednie dawki siarczanu dekstranu lub jego pochodnych do leczenia i/lub zapobiegania u ssaków, szczególnie człowieka, są dawkami, które dają średnie stężenie we krwi poniżej 5 mg/ml, prawdopodobnie poniżej 2 mg/ml i szczególnie poniżej 1 mg/ml. Korzystny zakresem stężeń jest zakres między 0,01 mg/ml a 1 mg/ml siarczanu dekstranu, jak powyżej 0,05 mg/ml, powyżej 0,08 mg/ml lub powyżej 0,1 mg/ml i/lub poniżej 0,8 mg/ml, poniżej 0,6 mg/ml, poniżej 0,4 mg/ml lub poniżej 0,2 mg/ml, np. w zakresie stężeń 0,01 mg/mi i 0,2 mg/ml i/lub 0,05 i 0,2 mg/mi. Udowodniono, że te stężenia w znacznym stopniu zapobiegają lub hamują IBMIR i morfologiczne rozerwanie i odrzucanie przeszczepów komórkowych, lecz są wystarczająco niskie, aby zminimalizować jakiekolwiek działania uboczne zazwyczaj związane ze stosowaniem siarczanu dekstranu. Dodatkowo, hodowanie wysepek w LIMW-DS nie powodowało żadnych działań ubocznych w odniesieniu do czynności wysepek w stężeniach w zakresie 0,01 do 1 mg/ml. W każdym przypadku lekarz lub osoba biegła w sztuce będzie w stanie określić faktyczną dawkę, która będzie najbardziej odpowiednia dla konkretnego pacjenta i która może być zróżnicowana w zależności od wieku, masy ciała i reakcji konkretnego pacjenta. Wyżej zdefiniowane dawki są przykładami korzystnych dawek w przeciętnym przypadku. Jednakże mogą wystąpić indywidualne sytuacje, w których większe lub mniejsze zakresy dawek będą konieczne i są one w zakresie wynalazku.

Obecnie siarczan dekstranu był już stosowany w badaniach klinicznych poświęconych leczeniu przeciwwirusowym infekcji HIV, leczeniem ostrego zawału mózgu w kombinacji z urokinazą i w terapii obniżającej poziom lipidów, gdzie siarczan dekstranu jest związany z fazą stałą. W dwóch poprzednich rodzajach badań tempo wstrzykiwania wynosiło około 45 mg/godzinę i było podtrzymywane przez okres 2-3 tygodni przez stałe wstrzykiwanie siarczanu dekstranu (MW 8000 (8000Da)), a stężenie we krwi wynosiło około 0,01 mg/ml. U wszystkich tych pacjentów obserwowano trombocytopenię (czasami związaną z krwawieniem) po 3 dniach leczenia i u około połowy obserwowano wyłysienie. Jednak10

PL 216 067 B1 że oba te działania uboczne były odwracalne. Ocenia się, że podawanie siarczanu dekstranu w celu zahamowania IBMIR, morfologicznego rozerwania i/lub odrzucania przeszczepów komórkowych zazwyczaj jest dokonywane przez okres do 1-2 lub kilku dni. Dlatego wyżej zidentyfikowane działania uboczne będą bardzo łagodne w czasie tak krótkiego okresu podawania (kilka dni w porównaniu z 2-3 tygodniami).

Od dawna wiadomo, że siarczan dekstranu wywołuje podciśnienie poprzez uwalnianie bradykininy wywołane przez aktywację kalikreiny w osoczu. Jednakże tej obserwacji dokonano pierwotnie, gdy HIMW-DS był unieruchomiony na kolumnach do plazmaferezy w czasie leczenia hiperlipemii, a nie w czasie wstrzykiwania siarczanu dekstranu. To działanie jest konsekwencją bezpośredniej aktywacji FXII do FXIIa. Jednakże w niniejszym dokumencie zwraca się uwagę, że czynnik XII nie jest bezpośrednio aktywowany przez LMW-DS. Jak wspomniano wyżej, poziomy FXIIa-AT i PAP są podwyższone, gdy komórki są poddane działaniu obcej krwi bez LMW-DS. Jednakże te wysokie poziomy są normalizowane, gdy dodany jest LMW-DS.

W celu zapobieżenia IBMIR po przeszczepie komórkowym i/lub morfologicznemu rozerwaniu i odrzucaniu przeszczepu komórkowego, korzystnie jest uzyskiwane stężenie terapeutyczne siarczanu dekstranu lub jego pochodnych w miejscu przeszczepu po wykonaniu przeszczepu komórkowego. Może to być osiągnięte przez podawanie siarczanu dekstranu przed faktyczną transplantacją. Alternatywnie, komórki lub gniazda komórek, które mają być przeszczepione pacjentowi, mogą być wstrzykiwane w postaci rozpuszczonej w roztworze zawierającym siarczan dekstranu według niniejszego wynalazku. Stężenie siarczanu dekstranu w takich komórkach lub roztworze siarczanu dekstranu jest korzystnie wystarczająco duże, tak że terapeutyczne stężenie siarczanu dekstranu, tj. korzystnie poniżej 5 mg/ml, a korzystniej w zakresie 0,01 mg/ml do 1 mg/ml może być (miejscowo) uzyskane w miejscu przeszczepienia w ciągu pierwszych godzin po przeszczepieniu. Znawca rozumie, że faktyczne stężenie siarczanu dekstranu lub jego pochodnych może być chwilowo wyższe niż optymalne stężenie we krwi pacjenta, gdy komórki lub gniazda komórek są przeszczepiane w postaci rozpuszczonej w roztworze siarczanu dekstranu. Później siarczan dekstranu dyfunduje z miejsca przeszczepienia, co obniża miejscowe stężenie siarczanu dekstranu. W pewnych zastosowaniach nie potrzeba dodatkowej ilości siarczanu dekstranu, aby zahamować IBMIR, morfologiczne rozrywanie i/lub odrzucanie przeszczepu komórkowego, ponieważ terapeutyczne stężenie siarczanu dekstranu może prawdopodobnie być wymagane w ciągu pierwszych 24-48 godzin po przeszczepie. Jednakże, gdy to jest wymagane, może być dodana dodatkowa ilość siarczanu dekstranu, np. dożylnie, dootrzewnowo lub jakąś inną drogą podania wymienioną wyżej. Jak wiadomo osobie biegłej w sztuce, podawanie roztworu siarczanu dekstranu zawierającego komórki lub gniazda komórek, które mają być przeszczepione, może również być połączone z podawaniem siarczanu dekstranu lub jego pochodnych przed faktycznym przeszczepieniem.

Zgodnie z dalszym aspektem wynalazku dostarczony jest preparat farmaceutyczny do stosowania w leczeniu IBMIR zawierający skuteczną ilość siarczanu dekstranu lub jego farmaceutycznie akceptowalnej pochodnej.

Wynalazek może być stosowany przy wykorzystaniu preparatu farmaceutycznego do stosowania w leczeniu odrzucania przeszczepu komórkowego zawierający skuteczną ilość siarczanu dekstranu lub jego farmaceutycznie akceptowalnej pochodnej i preparatu farmaceutycznego do stosowania w leczeniu morfologicznego rozrywania przeszczepionych komórek zawierający skuteczną ilość siarczanu dekstranu lub jego farmaceutycznej pochodnej.

Siarczan dekstranu i jego pochodne mogą również być łączone z innymi środkami terapeutycznymi, które są użyteczne w leczeniu odrzucania przeszczepionej tkanki. Odpowiednie, lecz nie ograniczające przykłady takich środków immunosupresyjnych, które mogą być używane razem z siarczanem dekstranu w leczeniu odrzucania przeszczepów to cyklosporyna, takrolimus, kortykosteroidy, rapamycyna (sirolimus) i mykofenolan mofetilu. Podawanie siarczanu dekstranu lub jego pochodnych według wynalazku może również być skoordynowane z podawaniem przeciwciał anty-TF i/lub miejscowo-inaktywowanego czynnika VIla, który wykazywał pewną czynność hamującą IBMIR.

P r z y k ł a d y

Odczynniki

Siarczan dekstranu o niskiej masie cząsteczkowej (LMW-DS) wynoszącej średnio 5000 (5000 Da) i o zawartości siarki około 17% uzyskano od Sigma Chemicals (St. Louis, MO, USA). Siarczan dekstranu o wysokiej masie cząsteczkowej (HMW-DS) wynoszącej średnio > 1000000 (1000000 Da) i o zawartości siarki 16-19% został zakupiony w Amersham Bioscience (Uppsala, Sweden). Dekstran

PL 216 067 B1 o niskiej masie cząsteczkowej (LMW-D; MW 5000 (5000 Da)) i dekstran o wysokiej masie cząsteczkowej (HMW-D; MW > 1000000 (1000000 Da)) uzyskano odpowiednio od Fluka Chemical (Buchs, Szwajcaria) I Sigma Chemicals (St. Louis, MO, USA).

Leczenie heparyną

Wszystkie materiały, które miały kontakt z pełną krwią były zaopatrzone w powierzchnię heparynową Corline (Corline Systems AB, Uppsala, Sweden) zgodnie z zaleceniami wytwórcy. Powierzch22 niowe stężenie heparyny wynosiło 0,5 μg/cm , odpowiadając około 0,1 j/cm ze zdolnością wiązania ₂ antytrombiny wynoszącą 2-4 pmol/cm²

Przygotowanie krwi

Świeża krew ludzka uzyskana od zdrowych ochotników, którzy nie otrzymywali żadnego leku przez co najmniej 14 dni, była pobierana do powierzchniowo-haparynizowanych strzykawek (rozmiar 18, Microlance, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Kaniule strzykawek były połączone z powierzchniowo-heparynizowanymi rurkami silikonowymi. W czasie pobierania strzykawki były stale obracane.

Zwierzęta

Samce myszy pozbawione grasicy uzyskane w wyniku chowu wsobnego (nu/nu Black-6, BomMice) z Bomholt Gaard Breeding and Research Centre, Ltd. (Ry, Dania), 20-25 g, zostały użyte jako biorcy. Wszystkie zwierzęta miały swobodny dostęp do standardowego pokarmu i wody.

Izolacja wysepek

Wysepki dorosłych świń (API) były izolowane z trzustek macior Swedish Landarace w wieku 2 do 3 lat (200 do 300 kg) za pomocą enzymatycznego i mechanicznego wytrawiania z następującą potem filtracją i separacją wysepek z gradientami Ficolla, jak sugeruje Ricordi i wsp. ([19] Ricordi C. I wsp. „A method for the mass isolation of islets from the adult pig pancrenas, Diabetes, Vol. 35, No. 6, str. 649-653 (1986); [20] Wennberg L. i wsp. „Diabetic rats transplated with adult porcine islets and immunosuppressed with cyclosporine A, mycophenolate mofetil, and leflunomide remain normoglycemic for up to 100 days, Transplantation, Vol. 71, Nr 8, str. 1024-1033 (2001)) Wysepki zostały zawieszone w pożywce hodowlanej M199 (GIBCO, BRL, Life Technologies LTD., Paisley, Szkocja) uzupełnionym 10% osoczem świńskim (GIBCO, BRL), 1 mM azotanem wapnia, 0,02 μΜ selenu, 20 mM amidu kwasu nikotynowego, 25 mM HEPES, Fungizonem (500 μg/Ι) i gentamycyną (50 mg/l) i były hodowane w kolbach 250 ml w 37°C w 5% CO2 i nawilżonym powietrzu przez 1 do 4 dni. Pożywka hodowlana była zmieniana w dniu 1 i następnie co drugi dzień. Objętość i czystość wysepek była określana za pomocą mikroskopu inwersyjnego po barwieniu ditizonem (Sigma Chemicals, St. Louis, MO).

Indukcja cukrzycy u myszy pozbawionych grasicy.

Cukrzyca była wywoływana u myszy pozbawionych grasicy przez dożylne (i.v.) wstrzyknięcie steptozocyny od Sigma Chemicals (Palo Alto, CA, USA) według Wenneberga i wsp. [20]. Dawka steptozocyny wynosiła 250 mg/kg masy ciała dla myszy pozbawionej grasicy. Zwierzę uznawano za chore na cukrzycę, jeżeli poziom glukozy we krwi (B-glukoza) przekraczał 20 mmoli/l (> 360 mg/dl) przez 2 lub więcej kolejnych dni.

Przeszczepianie API myszom pozbawionym grasicy chorym na cukrzycę leczonych lub nie leczonych LMW-DS.

Po hodowaniu przez 4 dni, 5 μΙ API (~ 5000 IEQs) z pięciu izolacji przeszczepiono do wątroby przez żyłę wrotną 11 samcom myszy pozbawionych grasicy chorych na cukrzycę uzyskanych w wyniku chowu wsobnego, które znieczulono w czasie operacji izofluranem. Pięć myszy leczono dożylnie LMW-DS. 0,15 mg LMW-DS wstrzykiwano na 10 minut przed przeszczepem i dodatkowe 0,3 mg wstrzykiwano 6 godzin po przeszczepie. Następnie LMW-DS. podawano dwa razy dziennie w dniach 1-2, 3-4 i 5-6 po przeszczepie w malejących dawkach 1, 0,5 i 0,25 mg, odpowiednio. Sześciu (nie leczonym) myszom wstrzykiwano równorzędne objętości soli w ten sam sposób.

Analiza statystyczna

Wszystkie wartości wyrażono jako średnie ± SEM i porównano przy użyciu ANOVA Friedmana (tabela 1), testu t-Studenta dla par (tabela 3), znakowanego testu rang Wilcoxona (tabela 4) i jednostronnego czynnikowego ANOVA po teście post hoc Scheffe'a (tabela 5). W morfologicznym badaniu przeszczepionych wysepek częstość tworzenia zakrzepu i intensywność infiltracji leukocytów oceniano przy użyciu testu sumy rang Wilcoxona. Wartości p < 0,0 5 były uważane za znaczące statystycznie.

Jakość wysepek

Test statycznej stymulacji glukozą (SGS) wykonywano jako test czynnościowy dla API. Piętnaście wysepek pobierano ręcznie i łagodnie wstrząsano w dwuwęglanie Krebsa-Ringera zawierającym

PL 216 067 B1

1,6 mM glukozy w 37°C przez 60 minut. Następnie zmieniano stężenie glukozy na 16,7 mM na kolejne 60 minut. Supernatanty zbierano i przechowywano w -20°C do czasu analizy. Zawartość insuliny w supernatantach analizowano testem ELISA (DAKO Diagnostics, LTD, Ely, UK). Indeks stymulacyjny obliczano odpowiednio jako stosunek stężenia insuliny przy dużym i przy małym stężeniu glukozy. Czystość API użytych w tym badaniu wahała się od 81 do 95% (średnio 88,5 ± 2,2%). Indeks stymulacyjny w teście statycznej stymulacji glukozą wynosił pomiędzy 0,8 a 7,8 (3,4 ± 1,2) i średnia zawartość insuliny wynosiła 85,5 ± 6,2 pmol/jg DNA.

Dodatkowo mierzono stosunek ADP/ATP w celu oceny przeżywalności API przy użyciu zestawu ApoGlow™ (LumiTech, Ltd., Nottingham, UK). W skrócie, 75 ekwiwalentów API (IEQ) przemywano PBS i następnie mieszano ze 100 μΙ odczynnika uwalniającego nukleotydy przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie 20 μΙ odczynnika monitorującego nukleotydy dodawano do roztworu i mierzono poziom API przy użyciu luminometru (FB 12 Luminometer, Berthold Detection Systems GmbH, Pforzheim, Niemcy) i wyrażano jako liczbę względnych jednostek światła (RLU). Po 10 minutach ADP w roztworze było przekształcane w ATP przez dodanie 20 μΙ odczynnika konwertującego i następnie mierzone jako liczba RLU. Następnie stosunek ADP/ATP w API obliczano, jak sugeruje Bradbury i wsp. ([21] Bradbury D. A. i wsp. „Measurement of the ADP;ATP ratio in humanleukaemic cell lines can be used as an indicator of cell viability, necrosis and apoptosis, J Immunol Methods, Vol. 240, Nr 1-2, str. 79-92 (2000)). Stosunek insulina/DNA w API mierzono według Wenneberga i wsp. ([22] Wennberg L. i wsp. Effects of immunosuppresive treatment on host responses againts intracerebral porcine neutral tissue xenografts in rats Transplantation, Vol. 71, Nr 12, str. 1797-1806 (2001)) i wyrażano w pmol/jg. Stosunek przeżywalności hodowanych API obliczano jako procent wartości IEQ uzyskanych w dniu 3 w porównaniu z dniem 0.

Jakakolwiek możliwa toksyczność LMW-DS była oceniana przez hodowanie API z trzech różnych trzustek w obecności (0,001, 0,1 lub 1 mg/ml) lub przy braku LMW-DS przez 3 dni. Wyniki badania przeżywalności, indeksu stymulacyjnego, stosunku ADP/ATP i stosunku insulina/DNA w próbkach kontrolnych i w próbkach z trzema różnymi stężeniami LMW-DS są ukazane w tabeli 1 poniżej. LMWDS nie wykazywał działania niepożądanego na czynność, żywotność lub przeżywalność API w jakimkolwiek z badanych stężeń. Ponadto nie było różnicy między morfologią API, na które działano LMWDS i API hodowanych przy braku LMW-DS.

T a b e l a 1

	API hodowane bez LMW-DS	API hodowane z LMW-DS. (0,01 mg/ml)	API hodowane z LMW-DS. (0,1 mg/ml)	API hodowane z LMW-DS (1 mg/ml)
Przeżywalność (% IEQ)	57,0 ± 5,2	43,6 ± 6,7	58,4 ± 4,3	68,9 ± 2,6
Indeks stymulacyjny w teście SGS	1,77 ± 0,17	2,26 ± 0,51	3,22 ± 0,89	1,42 ± 0,35
stosunek ADP/ATP	0,11 ± 0,03	0,08 ± 0,03	0,10 ± 0,03	0,11 ± 0,01
stosunek insuli- na/DNA (pmol/jg)	79,0 ± 11,4	66,1 ± 5,8	69,1 ± 9,6	71,6 ± 7,4

Czas krzepnięcia

Krew pobierano od czterech zdrowych ochotników do probówek Vacutainer^TM zawierających cytrynian. Pełna krew (980 μΙ) była inkubowana z 2 μΙ API w 37°C w pojemnikach z polipropylenu w reometrze ReoRox™ (Global Haemostasis International, Gothenburg, Szwecja).

Reakcję krzepnięcia rozpoczynano przez dodanie 20 μΙ 1 M CaCl2 w obecności lub przy braku różnych rodzajów dekstranu (LMW-DS, HMW-DS, LMW-D i HMW-D). Co 6 sekund pojemnik był wprawiany w dowolny skręcający ruch oscylacyjny wokół osi pionowej i rejestrowano tłumienie drgań i częstotliwość. Czas krzepnięcia identyfikowano jako punkt maksymalnego tłumienia drgań.

Wyniki uzyskane w eksperymentach nad czasem krzepnięcia są ukazane w tabeli 2 poniżej. API inkubowane we krwi ludzkiej z cytrynianem szybko indukowały tworzenie skrzepu, średnio w 6,1 ± 0,3 minuty po zwapnieniu. Tworzenie skrzepu było całkowicie zniesione w obecności LMW-DS we wszystkich badanych dawkach, podczas gdy HMW-DS hamował tworzenie skrzepu jedynie przy 0,1 mg/ml. Zarówno LMW-DS, jak i HMW-DS przedłużały czas krzepnięcia tylko w niewielkim stopniu

PL 216 067 B1 w porównaniu z próbkami kontrolnymi (brak dodatków). Tak więc, reakcja siarczanowania DS odgrywa kluczową rolę w obserwowanej zdolności hamującej.

T a b e l a 2

	Eksperyment 1	Eksperyment 2	Eksperyment 3	Eksperyment 4
Brak dodatków	5,6	6,3	6,9	5,5
LMW-DS (0,01 mg/ml)	>60	>60	>60	>60
LMW-DS (0,1 mg/ml)	>60	>60	>60	>60
HMW-DS (0,01 mg/ml)	15,8	36,9	21,0	38,3
HMW-DS (0,1 mg/ml)	>60	>60	>60	>60
LMW-D (0,01 mg/ml)	19,2	11,3
LMW-D (0,1 mg/ml)	25,2	25,8
HMW-D (0,01 mg/ml)	9,8	13,8
HMW-D (0,1 mg/ml)	14,2	33,2

Zahamowanie IBMIR przez LMW-DS.

Perfuzja wysepek dorosłych świń w heparynizowanych pętlach rurkowych z PVC była zastosowana jako model badania wpływu LMW-DS na IBMIR w ksenogennych przeszczepach od świni do człowieka. To badanie jest zasadniczo przeprowadzane, jak uprzednio opisano ([4] Bennet W. i ws.; [23] Gong J. i wsp. „Tubing loops as a model for cardiopulmonary bypass circuits: both the biomaterial and the blood-gas phase interfaces induce complement activation in an in vitro model, J Clin Immunol, Vol. 16, Nr 4, str. 222-229 (1996)) z pewnymi modyfikacjami. Ogólnie, używane były pętle utworzone z PVC (średnica 6,3 mm, długość 390 mm), których wewnętrzna powierzchnia została pokryta unieruchomioną heparyną. Te rurki były połączone za pomocą specjalnie zaprojektowanego heparynizowanego łącznika. Utworzono okrągłą pętlę, gdy końce łącznika ściśle połączono ze światłem końców rurki. Użyto wahadłowego aparatu umieszczonego w inkubatorze w 37°C w celu wytworzenia przepływu krwi wewnątrz pętli. Pętle były poddane ruchowi wahadłowemu w ustawieniu, które zapobiegało kontaktowi krwi z łącznikami.

Przeprowadzono siedem 60-minutowych eksperymentów przy użyciu API wyizolowanych od czterech różnych świń. LMW-DS., rozpuszczony w soli, był badany w stężeniach 0, 0,01, 0,1 i 1 mg/ml (stężenie końcowe). W każdym eksperymencie użyta była jedna pętla zawierająca świeżą krew ludzką i sól bez API jako kontrola. W dwóch eksperymentach zastosowana była jedna pętla zawierająca świeżą krew ludzką i 1 mg/ml LMW-DS bez API. Przeciwstawnie, badano wstępną inkubację ludzkiej krwi z 1 mg/ml LMW-dekstranu, który nie był siarczanowany. W każdym eksperymencie dodawano do każdej pętli 7 ml świeżej ludzkiej krwi od tego samego dawcy. Pętle były następnie umieszczane w urządzeniu wahadłowym na 5 minut z LMW-DS lub solą. Następnie otwierano pętle i dodawano do nich 100 μΙ soli z (lub bez) 5 μΙ API (około 5000 IEQ) i inkubowano ponownie przez 60 minut w urządzeniu wahadłowym w 37°C. Poziomy glukozy we krwi mierzono glukometrem (Glucometer Elite, Bayer Diagnostics, Leverkusen, Niemcy) przed perfuzją.

Po każdej perfuzji zawartość pętli była filtrowana przez filtry o średnicy 70 μm (Ficons, Cuptype, DAKO, Dania). Zarówno makroskopowe skrzepy krwi, jak i tkanka odzyskana z filtrów były szybko zamrażane w izopentanie w celu barwienia immunohistochemicznego. Pozostała filtrowana krew była zbierana w 4,1 mM EDTA (stężenie końcowe) i używana do analizy hematologicznej (płytki krwi, limfocyty, monocyty i granulocyty) i testów aktywacji krzepnięcia (trombina-antytrombina (TAT), czynnik XIa-kompleksy antytrombiny (FXIa-AT) i czynnik XIIa-kompleksy antytrombiny (FXIIa-AT), aktywacja

PL 216 067 B1 fibrynolizy (plazmina-kompleksy alfa 2 antyplazminy PAP), aktywacja dopełniacza (C3a i sC5b-9) i aktywacja inhibitora esterazy C1 (czynnik XIa-inhibitor esterazy C1 (FXIa-C1 INH), czynnik XIIainhibitor esterazy C1 (FXIIa-C1 INH). Analizowano również próbki pobrane po 0, 15 i 30 minutach. W próbkach 0-minutowych krwi nie dodawano do pętli rurki, lecz przenoszono bezpośrednio do rurek zawierających EDTA. Próbki krwi wirowano w 4°C przy 3290 x g przez 20 minut i osocze pobierano i przechowywano w -70°C do czasu analizy. Poziomy glukozy we krwi przez perfuzją API wynosiły od 4,8 do 6,2 mmol/l.

Liczbę płytek krwi i wzór odsetkowy leukocytów badano na analizatorze Coulter ACT-diff (Beckman Coulter, FL, USA) przy użyciu krwi poddanej działaniu EDTA. TAT i PAP obliczano przy użyciu dostępnych na rynku zestawów do immunologicznych testów enzymatycznych (EIA) (Enzygnost TAT, Behringswerke, Marburg, Niemcy, Immunoclone® PAP, American Diagnostica Inc., Greenweich, USA). FXIa-AT, FXIIa-AT, FXIa-C1 INH i FXIIa-C1 INH były analizowane zgodnie ze sposobem Sancheza i wsp. ([24] Sanchez J. i wsp. „Studies of adsorption, activation, and inhibition of factor XII on immobilized heparin, Thromb Res, Vol. 89, Nr 1, str. 41-50 (1998)). C3a analizowano, jak wcześniej opisano przez Nilssona Ekdahla i wsp. ([25] Nilsson Ekdahl K. i wsp. „Generation of iC3 at the interface between blood and gas, Scand J Immunol, Vol. 35, Nr 1, str. 85-91 (1992)) i sC5b-9 analizowano przy użyciu modyfikacji EIA opisanej przez Mollnesa i wsp. ([25] Nilsson Ekdahl I wsp. [25]; [26] Mollnes T. E. i wsp. „A new model for evaluation of biocompatibility: combined determination of neoepitopes in blood and on artificial surfaces demonstrates reduced complement activation by immobilization of herparin, Artif Organs, Vol. 19, Nr 9, str. 909-917 (1995)).

W rurkowatych pętlach zawierających świeżą krew ludzką bez API liczba krwinek i parametry krzepnięcia i dopełniacza były jedynie nieznacznie zmienione, jak ukazano w tabeli 3 poniżej. Wszystkie te zmiany są uważane za prawidłowe podstawowe zmiany wynikające z interakcji krwi z powierzchnią rurek i granicą faz płyn-powietrze.

LMW-DS zapobiegał makroskopowemu krzepnięciu, hamował zużywanie krwinek i zmniejszał krzepnięcie i aktywację dopełniacza w sposób zależny od dawki (patrz tabela 3). Znaczny wzrost liczby płytek krwi we krwi, na którą działano LMW-DS może być obserwowany przy 0,01 mg/ml LMW-DS., wykazując przywrócenie liczby krwinek do prawie normalnego poziomu już przy tym niskim stężeniu LMW-DS. Produkty aktywacji krzepnięcia TAT, FXIa-AT i FXIIa-AT były hamowane przy 0,01 mg/ml LMW-DS, lecz FXIa-AT nieznacznie wzrastał ponownie w dawkach od 0,1 do 1 mg/ml LMW-DS.

LMW-DS., zmniejsza aktywację dopełniacza, jak stwierdzono poprzez tworzenie C3a i rozpuszczalnego błonowego kompleksu atakującego sC5b-9, jak ukazano w tabeli 3. Fig. 1 ukazuje bardziej szczegółowo wpływ LMW-DS na tworzenie C3a w czasie 60 minut perfuzji API świeżą krwią modelu rurkowatej pętli. W próbkach, do których dodano LMW-DS, siarczan dekstranu był wstępnie inkubowany ze świeżą krwią ludzką przez 5 minut przed perfuzją API za pomocą krwi. Białe kółka odpowiadają 0 mg/ml LIMW-DS, czarne kółka odpowiadają 0,01 mg/ml LMW-DS i białe kwadraty i czarne kwadraty odpowiadają odpowiednio 0,1 mg/ml i 1 mg/ml LMW-DS. Odpowiedni diagram wpływu LMWDS na tworzenie sC5b-9 jest ukazany na fig. 2. Jak jasno widać na diagramach na fig. 1 i 2, zasadnicza aktywacja dopełniacza wystąpiła po około 30 minutach po perfuzji API. Podawanie 0,1 mg/ml i 1 mg/ml LMW-DS całkowicie hamuje tworzenie C3a i błonowego kompleksu atakującego sC5b-9, podczas gdy mniejsze stężenie LMW-DS (0,01 mg/ml) znacząco zmniejsza tworzenie C3a.

FXIa-Cl INH nie był tworzony w żadnej z badanych rurkowatych pętli w czasie 60 minut perfuzji (dane nie pokazane). FXIIa-C1 INH nie zmieniał się w obecności ani przy braku LMW-DS.

PAP wzrastał przy braku LMW-DS, podczas gdy był znacząco hamowany przy 0,01 mg/ml LMW-DS.

T a b e l a 3

Przed perfuzją	Po perfuzji
		Bez API	API z LMW-DS. (mg/ml)
			0	0,01	0,1	1
	(n=7)	(n=7)	(n=7)	(n=7)	(n=7)	(n=7)
Płytki (x 109/l)	252 ± 9,9	141,8 ± 11,8	6,4 ± 5,6	108,2 ± 12,9*	146,1 ± 8,1*	162,3 ± 8,9*

PL 216 067 B1 cd tabeli 3

Limfocyty (x 109/l)	2,15 ± 0,09	2,04 ± 0,10	1,66 ± 0,21	1,90 ± 0,11	1,91 ± 0,12*	1,89 ± 0,10
Monocyty (x 109/l)	0,39 ± 0,06	0,31 ± 0,02	0,15 ± 0,03	0,48 ± 0,10	0,40 ± 0,07*	0,31 ± 0,05*
Granulocyty (x 109/l)	2,90 ± 0,35	2,66 ± 0,36	1,17 ± 0,34	2,20 ± 0,40	2,80 ± 0,50*	2,92 ± 0,37*
TAT (pg/ml)	9,0 ±3,7	144,0 ± 63,8	7042,5±1314,1	645,3±177,4*	61,0 ± 8,6*	15,0 ± 5,6*
FXIa-AT ^mol/l)	0,03 ± 0,01	0,10 ± 0,03	3,00 ± 0,60	0,13 ± 0,01*	0,08 ± 0,01	1,17 ± 0,41*
FXIIa-AT ^mol/l)	0,05 ± 0,01	0,06 ± 0,01	2,02 ± 0,63	0,08 ± 0,02*
C3a(ng/ml) SC5b-9 (AU/ml)	63,0±7,8 24,0 ±2,7	590,2±105,3 104,7 ± 20,7	1122,51132,0 182,1 ± 33,4	630,6±103,4* 151,4 ± 27,9	191,7±36,6* 61,9 ± 6,5*	215,6±52,2* 53,9 ±7,1*
FXIIa-C1 inh^mol/l)	0,07 ± 0,01	0,09 ± 0,03	0,06 ± 0,01	0,10 ± 0,03
PAP ng/ml	1012,5 ± 224,0	443, ± 179,4	585,7 ± 240,9	398,2± 60,7*

* Znacząca różnica w porównaniu z pętlami API bez LMW-DS przy użyciu testu t-Studenta.

Wpływ dekstranu LMW na liczbę krwinek, krzepnięcie i parametry dopełniacza po 60 minutach perfuzji API świeżą krwią ludzką była badana za pomocą modelu pętli podobnej do LMW-DS, jak omówiono wyżej. Porównanie wpływem LMW-D i LMW-DS na objawy IBMIR przedstawiono w tabeli

4. Dekstran LMW, który nie jest siarczanowany, wywierał jedynie niewielki wpływ na IBMIR. Te dane wskazują, że siarczanowanie odgrywa kluczową rolę w hamującym wpływie na IBMIR wywoływane przez API.

T a b e l a 4

	LMW-DS. (1 mg/ml, n = 5)	LMW-D (1 mg/ml, n = 5)
Płytki krwi ( x 109/l)	181,1 ± 16,3*	44,9 ± 18,7
Limfocyty (x 109/l)	1,94 ± 0,12	2,14 ± 0,32
Monocyty (x 109/l)	0,38 ± 0,10	0,29 ± 0,08
Granulocyty (x 109/l)	3,23 ± 0,21*	1,90 ± 0,43
TAT (pg/ml)	12,8 ± 4,9	4429,2 ± 2002,5
FXIa-AT (pmol/I)	1,56 ± 0,82	1,09 ± 0,08
C3a (ng/ml)	171,5 ± 72,4*	1490,3 ± 406,4
SC5b-9 (AU/ml)	41,6 ± 11,5*	157,3 ± 19,1

* Znacząca różnica w porównaniu z pętlami API z LMW-D przy użyciu znakowanego testu rang Wilcoxona

Bezpośredni wpływ LMW-DS. na układ dopełniacza w osoczu ludzkim

Bezpośredni wpływ LMW-DS na kaskadę dopełniacza był badany przez inkubowanie osocza ludzkiego w probówce w polipropylenu. Osocze (1 mI) było dodawane do każdej probówki razem LMW-DS w ostatecznym stężeniu 0, 0,01, 0,1 lub 1 mg/ml. Po 5, 10, 15, 30, 45 i 60 minutach inkubacji osocza w 37°C, 100 μΙ osocza przenoszono do probówek zawierających 10 mM EDTA, Te próbki były przechowywane w -70°C przed analizą komponentów dopełniacza C3a i sC5b-9.

Fig. 3 ilustruje działanie LMW-DS na obecność C3a i sC5b-9 układu dopełniacza w osoczu ludzkim. Wartości są wyrażone jako procent ilości C3a i sC5b-9 w próbkach kontrolnych (bez LMW-DS). Zaciemnione prostokąty oznaczają tworzenie C3a, a niezaciemnione oznaczają sC5b-9. W 0,01 mg/ml

PL 216 067 B1

LMW-DS, zwiększona aktywacja dopełniacza jest odzwierciedlona w zwiększonym tworzeniu C3a i sC5b-9, lecz w 1 mg/ml obserwowano efekt hamujący. Mimo, że działanie na pełną krew i osocze nie może być bezpośrednio porównane, sam LMW-DS prawdopodobnie indukuje aktywację dopełniacza w najniższej dawce użytego LMW-DS. W wyższych stężeniach przeważa działanie hamujące.

Przeżywalność przeszczepu u myszy pozbawionych grasicy chorych na cukrzycę

Poziomy glukozy były mierzone we krwi pobranej z ogonów biorców przy użyciu urządzenia do _® mierzenia poziomu B-glukozy Glucometer Elite^® (Bayer AB, Gothenburg, Szwecja). Pomiary były wykonywane codzienne przed godziną 12 i wyrażane w mmolach/l (1 mmol/I = 18 mg/dl). Za wystąpienie zaniku czynności przeszczepu uznawano wzrost poziomu B-glukozy powyżej 11,1 mmola/l (> 200 mg/dl) przez 2 lub więcej kolejnych dni. Czas występowania prawidłowego poziomu glukozy (< 200 mg/dl) zdefiniowano jako okres przeżywaIności przeszczepu.

U wszystkich indukowanych streptozocyną myszy pozbawionych grasicy chorych na cukrzycę obserwowano znaczną hiperglikemię przed przeszczepem, bez różnic w poziomie B-glukozy między różnymi grupami biorców. Poziom B-glukozy po posiłku był zmniejszony bezpośrednio po przeszczepie u wszystkich biorców chorych na cukrzycę, którym wszczepiono API do żyły wrotnej. Jednakże, nie leczone myszy zachowywały prawidłowy poziom glukozy przez krótki okres, patrz tabela 5. Poziom B-glukozy wzrastał znowu w czasie pierwszych 3 dni po przeszczepie u 4 z 6 nie leczonych myszy. W przeciwieństwie do tego, prawidłowy poziom glukozy utrzymywał się przez znacznie dłuższy czas u myszy leczonych LMW-DS niż u nie leczonych myszy (8,8 ± 1,9 dnia w porównaniu z 3,5 ± 1,2 dnia, p = 0,045, tabela 5). Wykazano, że wszystkie API użyte w niniejszym badaniu leczyły myszy pozbawione grasicy chore na cukrzycę, gdy równorzędne ilości były przeszczepiane do przestrzeni podtorebkowej nerki (usunięcie nerki z przeszczepem powodowało szybki wzrost poziomu glukozy).

T a b e l a 5

Miejsce implantacji	Leczenie	n	Indywidualna przeżywalność przeszczepu (dni)	Średnia przeżywalność przeszczepu (dni)
Wątroba	sól	6	1, 1, 2, 3, 6, 8	3,5 ± 1,2*
LMW-DS.	5	4, 6, 8, 12, 14	8,8 ± 1,9*
Przestrzeń podtorebkowa nerki	-	5	> 56 ( x 5)	> 56*

* Znaczące we wszystkich grupach

Eksperymenty immunohistochemiczne

Wysepki i makroskopowe skrzepy odzyskiwano na filtrach po 60 minutach perfuzji krwią z LMW-DS (0,1 mg/ml i 1mg/ml) lub bez LMW-DS (kontrola), następnie zbierano w podłożu zatapiającym (Tissue-Tek; Miles, Eckhart, IN, USA) i szybko zamrażano w izopentanie. Wysepki były wycinane i następnie barwione peroksydazą chrzanową (HRP) sprzężoną z mysim antyludzkim CD41a (R&D Systems, Abigdon, WIk. Brytania) i anty-CD11b⁺ (Clone 2LPM 19c, DAKO, Carpinteria, CA, USA). W badaniu in vivo wątroby myszy zawierające API odzyskano po 10 dniach po przeszczepie i zamrożono szybko w izopentanie. Próbki były wycinane i barwione anty-insuliną świnki morskiej (DAKA, Carpintera, CA, USA) i szczurzym anty-mysim CD11b⁺ (Serotec Ltd, Skandynawia, Oslo, Norwegia).

Po 60 minutach stwierdzono, że wysepki uzyskane z nie poddawanych działaniu leku pętli kontrolnych są otoczone skrzepami. Barwienie immunohistochemiczne wykazało obecność kapsuły fibryny i płytek krwi wokół wysepek. Fig. 4 ilustruje infiltrację komórek cechujących się różnokształtnością jąder komórkowych CD11b⁺ i monocytów w wysepkach kontrolnych. W przeciwieństwie do tego obserwowano całkowite zahamowanie tworzenia skrzepu i zmniejszenie liczby infiltrujących komórek CD11b⁺, gdy dodawano 1 mg/ml LMW-DS w czasie inkubacji, co ilustruje fig. 5. Podobny efekt był również obserwowany przy 0,1 mg/ml. Próbki kontrolne również wykazywały grubą warstwę płytek krwi przylegających do komórek, co ukazuje fig. 6. Znacznie cieńsza warstwa płytek krwi przylegająca do wysepek była obserwowana w próbkach poddanych działaniu LMW-DS., co ilustruje fig. 7. Wysepki kontrolne nie poddane działaniu krwi były negatywne w każdym barwieniu.

Większość wysepek odzyskanych od nie leczonych myszy była otoczona skrzepami, co ilustruje fig. 8. Na fig. 8 strzałka oznacza tworzenie skrzepu otaczającego wysepki świńskie. Jednakże tylko kilka wysepek od myszy leczonych LMW-DS było otoczonych, co ilustruje fig. 9. Barwienie immunohistochemiczne wykazało infiltrację leukocytów CD11b⁺ (MAC-1⁺) w wysepkach uzyskanych od nie leczonych myszy, co ukazuje fig. 10. W przeciwieństwie do tego, obserwowano znacznie mniej infiltrująPL 216 067 B1 cych komórek CD11b⁺ (MAC-1⁺) u myszy leczonych LMW-DS., co ilustruje fig. 11. Częstość tworzenia skrzepu i intensywność infiltracji leukocytów była znacząco mniejsza u biorców leczonych LMW-DS niż u nie leczonych biorców (p = 0,034). Fig. 4 do 9 są powiększeniem 200x i fig. 10 i 11 są powiększeniem 100x.

Znawca rozumie, że różne modyfikacje i zmiany mogą być dokonane w niniejszym wynalazku bez odbiegania od jego zakresu, który jest zdefiniowany przez załączone zastrzeżenia patentowe.

Claims (16)

1. Zastosowanie siarczanu dekstranu lub jego farmaceutycznie akceptowalnej soli lub solwatu do wytwarzania leku do leczenia Natychmiastowej Reakcji Zapalnej Za Pośrednictwem Krwi (IBMIR).

2. Zastosowanie siarczanu dekstranu według zastrz. 1, znamienne tym, że wspomniana IBMIR jest spowodowana przez wystawienie przeszczepu komórkowego na działanie krwi po przeszczepie wspomnianego przeszczepu komórkowego do organizmu obcego biorcy.

3. Zastosowanie siarczanu dekstranu według zastrz. 2, znamienne tym, że wspomniany przeszczep komórkowy jest przeszczepiany do organizmu człowieka.

4. Zastosowanie siarczanu dekstranu według zastrz. 2 albo 3, znamienne tym, że wspomniany przeszczep komórkowy jest wybrany z listy zawierającej:

- allogeniczny przeszczep komórkowy i - ksenogenny przeszczep komórkowy.

5. Zastosowanie siarczanu dekstranu według zastrz. 2 albo 3, znamienne tym, że wspomniany przeszczep komórkowy jest wybrany z listy zawierającej;

- indywidualną komórkę;

- gniazdo komórek i - nie-unaczynioną tkankę.

6. Zastosowanie siarczanu dekstranu według zastrz. 2 albo 3, znamienne tym, że wspomniany przeszczep komórkowy stanowi wysepki Langerhansa.

7. Zastosowanie siarczanu dekstranu według zastrz. 1 albo 2 albo 3, znamienne tym, że wspomniany siarczan dekstranu ma masę cząsteczkową poniżej 20000, korzystnie poniżej 10000.

8. Zastosowanie siarczanu dekstranu według zastrz. 1 albo 2 albo 3, znamienne tym, że wspomniany siarczan dekstranu zawiera 10 - 25%, korzystnie 15 - 20% siarki.

9. Zastosowanie siarczanu dekstranu lub jego farmaceutycznie akceptowalnej soli lub solwatu do wytwarzania leku do leczenia stanu wybranego z grupy obejmującej morfologiczne rozerwanie przeszczepionego przeszczepu komórkowego oraz odrzucenie przeszczepu komórkowego.

10. Zastosowanie siarczanu dekstranu według zastrz. 9, znamienne tym, że wspomniane morfologiczne rozerwanie przeszczepu komórkowego lub odrzucenie przeszczepu komórkowego jest spowodowane Natychmiastową Reakcją Zapalną Za Pośrednictwem Krwi (IBMIR).

11. Zastosowanie siarczanu dekstranu według zastrz. 9 albo 10, znamienne tym, że wspomniany przeszczep komórkowy jest przeszczepiany do organizmu człowieka.

12. Zastosowanie siarczanu dekstranu według zastrz. 9 albo 10, znamienne tym, że wspomniany przeszczep komórkowy jest wybrany z listy zawierającej:

- allogeniczny przeszczep komórkowy lub

- ksenogenny przeszczep komórkowy.

13. Zastosowanie siarczanu dekstranu według zastrz. 9 albo 10, znamienne tym, że wspomniany przeszczep komórkowy jest wybrany z listy zawierającej:

- indywidualną komórkę;

- gniazdo komórek lub

- nie-unaczynioną tkankę.

14. Zastosowanie siarczanu dekstranu według zastrz. 9 albo 10, znamienne tym, że wspomniany przeszczep komórkowy stanowi wysepki Langerhansa.

15. Zastosowanie siarczanu dekstranu według zastrz. 9 albo 10, znamienne tym, że wspomniany siarczan dekstranu ma masę cząsteczkową poniżej 20000, korzystnie poniżej 10000.

16. Zastosowanie siarczanu dekstranu według zastrz. 9 albo 10, znamienne tym, że wspomniany siarczan dekstranu zawiera 10 - 25%, korzystnie 15 - 20% siarki.